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過氧化物酶活性的測定實驗報告,過氧化物酶pod活性測定實驗報告

本文目錄
1.過氧化物酶pod活性測定實驗報告2.過氧化物酶活性的測定比色法3.過氧化物酶活性的測定實驗報告總結與反思4.過氧化氫酶的測定

過氧化物酶pod活性測定實驗報告

文章插圖
過氧化物酶活性的測定比色法實驗
48
過氧化物酶活性的測定（比色法）
過氧化物酶是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有密切關系，在植物生長發育過程中，它的活性不斷發生變化，因此測量這種酶，可以反映某一時期植物體內代謝的變化。
一、原理
在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創木酚氧化，生成茶褐色物質，該物質在
470
nm
處有最大吸收，可用分光光度計測量
470
【?過氧化物酶活性的測定實驗報告,過氧化物酶pod活性測定實驗報告】nm
的吸光度變化測定過氧化物酶活性。
二、實驗材料、試劑與儀器設備
（一）實驗材料
馬鈴薯塊莖。
（二）試劑
1
．
100
mmol
／
L
磷酸緩沖液
pH6.0
（見附錄）。
2
．反應混合液：
100
mmol
／
L
磷酸緩沖液（
pH6.0
）
50
mL
于燒杯中，加入愈創木酚
28
μl
，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創木酚溶解，待溶液冷卻后，加入
30
%
過氧化氫
19
μl
，混合均勻，保存于冰箱中。
（三）儀器設備
分光光度計，研缽，恒溫水浴鍋，
100
mL
容量瓶，吸管，
離心機。
三、實驗步驟
1
．稱取植物材料
1
g
，剪碎，放入研缽中，加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿，以
4000
r
／
min
離心
15
min
，上清液轉入
100
mL
容量瓶中，殘渣再用
5
mL
磷酸緩沖液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，貯于低溫下備用。
2
．取光徑
1
cm
比色杯
2
只，于
1
只中加入反應混合液
3
mL
和磷酸緩沖液
1mL
，作為對照，另
1
只中加入反應混合液
3
mL
和上述酶液
1mL
（如酶活性過高可稀釋之），立即開啟秒表記錄時間，于分光光度計上測量波長
470
nm
下吸光度值，每隔
1min
讀數一次。
四、結果計算
以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大?。?匆?
ΔA
470
/[min
?
g
（鮮重）
]
表示之。也可以用每
min
內
A
470
變化
0.01
為
1
個過氧化物酶活性單位（
u
）表示。
過氧化物酶活性
[u/
（
g
?
min
）
]=
式中：
Δ
A
470
——反應時間內吸光度的變化。
W
——植物鮮重，
g
。
V
T
——提取酶液總體積，
mL
。
V
s
——測定時取用酶液體積
,
mL
。
t
——反應時間，
min
。

文章插圖
過氧化物酶活性的測定實驗報告總結與反思影響酶活性的因素”是高中現行生物學課本中的一個實驗內容，也是第1個探究性實驗。但是，教材中所介紹的實驗藥品（α-淀粉酶）價格較貴，實驗設計思路為定性實驗。能否改進實驗設計方案，使其不僅能培養學生的實驗技能和實驗設計能力，通過實驗過程理解影響酶活性的因素的知識內容，而且促使學生積極參與探究活動，養成實事求是的科學態度和一絲不茍的科學探究精神呢？為此，筆者進行了一些有益的嘗試。
1 實驗設計
1．1 選用過氧化氫酶作為實驗探究對象過氧化氫是細胞中某些化學反應的副產物，具有強氧化性，如果不及時除去或分解，就會殺死細胞。在動物的肝細胞和血細胞中含有較多的過氧化氫酶，它可以促進過氧化氫分解。由于過氧化氫酶容易獲得且催化反應的現象明顯，所以選用過氧化氫酶作為實驗探究對象。
1．2 設備準備實驗用具有：細胞培養瓶（代替反應小室）、刻度吸管、鑷子、水槽、25 mL量筒；反應底物為30％H2O2，也可以用原包裝雙氧水配制的3％H2O2 ，但反應速度慢，現象不太明顯，反應時間長。
實驗中需要 H2O2酶濾紙片，制作方法是：將 10 g鮮肝剪碎，置于研缽中充分研磨，加入200 mL蒸餾水制成鮮肝液。然后，將濾紙剪成1 cm2的小片，平展在表面皿中，用鮮肝液浸泡l min后使用。
配制緩沖液，方法是：將17.96 g Na2HPO4·7H2O在 1 000 mL容量瓶內溶于蒸餾水中，加水至刻度，配制成0.067 mol／L Na2HPO4溶液。將9.07 g KH2PO4在1 000 mL容量瓶內溶于蒸餾水中，加水至刻度，配制成0.067 mol／L KH2PO4溶液。用上述兩種溶液配制pH5、pH6、pH7、pH8緩沖液如下：
單位：mL
pH
5
6
7
8
0.067 mol／L KH2PO4
0.067 mol／L KH2PO4
1
99
20
80
60
40
95
5
1．3 實驗方案參照美國BSCS教材中的實驗方案，經過1個多月的摸索，改進原有實驗裝置，制定出簡單易行且定量效果好的實驗步驟如下：
l）向水槽中加水至將滿為止。
2）將大小相同的8片濾紙片在鮮肝液中浸泡l min，然后用鑷子夾起濾紙片，靠在培養皿壁上，使多余的酶液流盡。
3）用鑷子將2片酶濾紙片小心地放入細胞培養瓶（用作反應小室）的一側內壁上，使酶濾紙片粘在內壁上。注意濾紙片不要碰到反應小室的瓶口。
4）將細胞培養瓶立起，貼有酶濾紙片的一側壁沖上，小心加入 pH＝5的緩沖液 2 mL ，然后再加入 2 mL 30％的H2O2溶液，切勿使上述混合液接觸貼在內壁上的濾紙片。將小室塞緊。
5）將25 mL量筒橫放于水槽中使之灌滿水，若有氣泡，將其輕輕傾斜，小心趕出氣泡。將量筒倒立，使筒口一直處于水中。
6）小心將細胞培養瓶平放在水槽中的水里，注意反應小室貼有濾紙片的內壁應在上面，將量筒移至細胞培養瓶口上伸出的玻璃管上方，實驗過程中要一直扶著量筒，保證量筒的位置不動。
7）將細胞培養瓶小心旋轉180度，使H2O2溶液接觸酶濾紙片。同時開始計時，在 30 S時，讀取量筒水平面刻度并作出標記后記錄。
8）反復沖洗反應小室后，重復上述實驗過程，測量在 pH6、pH7、pH8時過氧化氫在酶的催化下所釋放的氣體量。注意：所有的實驗中都要嚴格保證于凈，不應該有上一次反應后的剩余溶液，每次試驗完后，應充分沖洗，然后用相應的緩沖液再沖洗一遍。
2 教學過程
2．1 引入新課由上節課的實驗操作引出本節課的實驗內容，啟發學生思考實驗操作要達到的目的，為減少學生實驗操作過程的盲目性做好鋪墊。
學生作出溫度和pH影響酶的活性的假設后，教師介紹本節課所用的酶和底物，以及過氧化氫酶在生物體內的分布情況。然后播放自制錄像《pH過氧化氫酶活性的影響》，邊看錄像邊講解實驗用具，但是不強調實驗操作過程中的注意事項，意在訓練學生的觀察能力、對問題的敏感能力、綜合分析能力。如果某一學生只是在被動地看錄像而不是邊看邊思考，在自己具體實驗過程中會遇到很多問題，使實驗進程不順利。而在看錄像過程中積極思考的學生，實驗每一步的操作應該注意的問題都會關注到，實驗速度快且實驗結果準確。
2．2 學生分組實驗學生模仿錄像中的操作進行自主實驗，既需要分工合作，更需要在操作中發現問題并及時解決問題。這個過程中教師巡視學生的操作情況并適時地參與討論，針對不同組的情況，提出一些小問題，引導學生進行深層次的思考。
實驗中教師巡視，既可以了解學生實驗的速度、實驗過程中出現哪些不可預計的問題，使自己很好地駕馭課堂教學，又作為學習者參與討論過程，營造寬松和諧的學習氛圍。
2．3 交流和討論實驗結束后，教師請各組學生代表匯報實驗結果，確定過氧化氫酶的最適pH，在交流過程中學生會發現不同組得出的實驗結論可能有所不同。綜合全班的實驗結果，還是可以看出過氧化酶的最適宜pH是7 。然后教師告訴學生，科學家研究得出：肝臟中過氧化酶的最適pH是6.8，接近于7 。但是大家的實驗結果各不相同，由此引出實驗討論的問題：實驗過程中有哪些因素可能造成實驗誤差？學生針對自己的實驗操作過程進行充分的討論，總結出影響實驗結果的一些因素。這是學生回憶實驗操作進行自我反省和相互評價的過程，但是很少有學生對教師提供的實驗方案表示質疑，為此教師又提出另外一個討論題：你認為該實驗設計中有哪些不完善的地方？應如何改進實驗裝置或方案，使實驗結果更準確？一個小小的問題點燃了學生質疑的火花，大家各抒己見，提出改進實驗方案的建議，學生的發散思維和創新思維在此體現得淋漓盡致。教師對學生的發言進行了充分的肯定，激發了學生的學習熱情和積極性。因為實驗步驟中只設計了pH為5－8的實驗，所以教師又提出一個簡單的問題：如果想得出不同的pH與酶活性關系的變化曲線，應該如何設計？由此引導學生思考實驗目的不同，實驗設計的步驟和方案可能有所不同，實驗設計需要有針對性。
2．4 實驗設計思路的遷移──設計并交流溫度對酶活性影響的實驗方案進行充分的討論后，教師又提出問題：知道了不同的pH與酶活性的關系，現在請同學們設計“探究溫度如何影響酶的活性”的實驗方案。提醒學生注意底物和相應的實驗裝置的選擇。給學生一段時間思考后，教師請學生交流實驗方案。有的學生在教師提供的實驗用具的基礎上設計，有的學生利用化學中制備氫氣的啟普發生器作為反應體系，這樣實驗結果更加準確。但有的學生考慮得更加全面，想到H2O2在高溫的情況下也會加速分解，用過氧化氫酶和H2O2探究溫度的影響不太適合，所以改用淀粉作底物，唾液淀粉酶作催化劑。在這個交流過程中，學生相互評價實驗的可行性，并且給予每組學生一些合理的建議。該過程充分體現了學生深入研究問題的能力。
3 教學小結和反思
生物科學實驗中可以對學生進行探究過程的訓練。包括觀察、提出問題、進行假設、設計方案并進行實施、收集分析解讀數據、得出合理結論、表達結果等。是學習者運用判斷思維、邏輯思維進行學習的過程。在這個過程中，要很好地把握教師的主導作用和學生的主體作用，保證課堂教學的高效優質。避免出現盲目而無序，熱鬧而無獲的情況。探究教學對教師駕馭課堂和教學內容的能力都提出了更高的要求。因此在授課前教師必須精心準備，要預見到可能發生的所有情況，尤其是實驗安全性問題。
對實驗結果的分析討論和自主設計實驗是本節課的重點，在這個過程中培養了學生多方面的能力：與他人的合作意識、分析綜合的思維能力、表達與交流的能力、實事求是的科學態度、自我評價與評價他人的能力、創新能力等。但是能力的培養不是一朝一夕的事情，應該滲透到每堂課的教學中．滲透到教學的點點滴滴，朱意曾說過“讀書無疑，需教有疑，有疑者無疑，至此方是長進”，在教學過程中，精心設問，周密安排，每堂課要給學生提供施展自己才華的舞臺，長此以往，學生的各種能力會逐步得到提高乃至升華。
探究過程中教師應該注意自己扮演的是和學生平等的學習者而不是高高在上的知識的傳授者，和學生共同探討，可能從學生那里會獲得更多的靈感和信息，反過來促進自己的教學。
如果時間允許，可以用2節課的時間，給學生提供必需的實驗器材和用品，分組實施自己設計的“溫度對酶活性的影響”方案，檢驗自己方案的可行性。這是一個自我價值的實現過程，相信在這一過程中更能激發學生學習生物學的熱情，是培養學生學習生物學興趣不可多得的契機。

文章插圖
過氧化氫酶的測定你好?。?
使用過氧化氫酶檢測試劑盒是比較簡便的方法：
過氧化氫酶檢測試劑盒(Catalase Assay Kit)是一種簡單易行的通過顯色反應來檢測細胞、組織或其它樣品中過氧化氫酶
(Catalase)活性的試劑盒。在過氧化氫相對比較充足的情況下，過氧化氫酶可以催化過氧化氫產生水和氧氣。殘余的過氧化
氫在過氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物，產生紅色的產物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p-
benzoquinonemonoimine)，最大吸收波長為520nm 。用過氧化氫標準品，制作標準曲線，這樣就可以計算出樣品中的過氧化氫
酶在單位時間單位體積內催化了多少量的過氧化氫轉變為水和氧氣，從而可以計算出樣品中過氧化氫酶的酶活力。
? 過氧化氫酶分布非常廣泛。在肝臟、腎臟和紅細胞中，過氧化氫酶的水平非常高，這些器官和細胞是清除能導致氧化損傷的過氧
化氫的主要場所。
? 過氧化氫酶的活性也可以用紫外分光光度計測定A240，但蛋白質或其它組份在A240附近都有比較強的吸收，會對測定產生嚴重干
擾。因此，用紫外法測定過氧化氫酶的活性，比較適合純化的過氧化氫酶。本試劑盒通過檢測A520來測定過氧化物酶催化下由過
氧化氫氧化生色底物產生的紅色產物，受干擾的因素?。?檢測靈敏度高，可以檢測出低達1U/ml的過氧化氫酶。
? 本試劑盒可以檢測全血、紅細胞裂解產物、血清、組織勻漿產物、細胞裂解產物等生物樣品中的過氧化氫酶的活性。一個試劑盒
共可以進行100次檢測。
使用方法：
配制250mM過氧化氫溶液。本試劑盒提供的過氧化氫濃度約為1M 。由于過氧化氫不是非常穩定，使用前需自行測定過氧化氫的
實際濃度。把濃度約為1M的過氧化氫用本試劑盒提供的過氧化氫酶檢測緩沖液稀釋100倍，使過氧化氫的濃度約為10mM 。測定
A240 。
過氧化氫(mM)=22.94XA240
從而計算出本試劑盒提供的過氧化氫的實際濃度。然后再根據實際的過氧化氫濃度配制250mM過氧化氫溶液。
b. 配制5mM過氧化氫溶液。根據測定得到的實際過氧化氫濃度配制5mM過氧化氫溶液。
c. 配制顯色工作液。在冰浴上溶解顯色底物，適當分裝后再使用，盡量避免反復凍融。其它試劑放置在冰浴上備用。取適當量的過
氧化物酶，按照1:1000的比例用顯色底物稀釋，配制成顯色工作液。例如取5微升過氧化氫酶，加入5ml顯色底物，混勻即得到
5ml顯色工作液。
2. 樣品的準備：
用適當的裂解液裂解細胞或組織(可以使用碧云天生產的Western及IP細胞裂解液進行裂解) 。用本試劑盒提供的過氧化氫酶檢測
緩沖液稀釋樣品，裂解好的樣品至少加入等體積的過氧化氫酶檢測緩沖液進行稀釋。具體的稀釋倍數可以參考表1 。

文章插圖
以上就是關于過氧化物酶活性的測定實驗報告,過氧化物酶pod活性測定實驗報告的全部內容，以及過氧化物的相關內容,希望能夠幫到您。

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